PCR实验室污染产生的途径及控制措施

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR） 技术是20世纪80年代慢慢发展起来的一种体外基因扩增技术。它通过重复高温变性、低温退火和延伸三个循环，在很短的一定时间内将极微量的靶核酸扩增上百万倍， 得到大量特定目的基因片段，所以它最大的特点就是具有较高的扩增能力与极高的灵敏性，但与之并存的另一个特点就是易污染，极其微量的污染都有可能导致假阳性的产生。PCR技术在医学领域重点应用于临床医学和预防医学中，大多数病原体都可通过PCR检测为人类疾病的防治提供新的检测手段。为保证结果的可靠性和准确性,学习掌握PCR实验室污染产生的途径及控制措施至关重要。

PCR污染是指由于各种原因，造成的PCR扩增体系中出现了非目的检测样本本身的模板，使得PCR结果出现假阳性。从样品开始采集到结果报告发出，任何一处细小的失误都会造成检测结果的偏差，极其微量的污染都容易导致样品出现假阳性结果。

为避免结果假阴性、假阳性以及出现误差，需要实验室人员及时发现实验室存在的不足并加以改正，这样才能为临床的进一步治疗提供最精准的数据。

PCR污染的4种来源

1、标本或模板间的交叉污染

收集样本的容器被污染；标本放置时，由于密封不严溢于容器外；容器外黏有标本造成相互间交叉污染；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；标本核酸模板在提取过程中，不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

2、PCR试剂的污染

主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样器、容器、水及其他溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR扩增产物的污染

这是PCR中最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染就可形成假阳性。

4、实验室克隆质粒的污染

在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的实验室， 这个问题也比较常见。克隆质粒在单位容积内浓度高，另外在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及其具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

PCR污染的防治措施

按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

1.工作区域的严格划分

各个实验区域设置合理， 根据《CNAS-CL36医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》要求， 合理分隔实验室。

试剂准备区：进行试剂的贮存及配制等相关操作以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

标本制备区：进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定 RNA 时cDNA 的合成。

扩增区：DNA扩增。

扩增产物分析区：扩增产物的分析测定，如电泳、测序等。

每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。各区标签颜色：绿色（第一区）、白色（第二区）、蓝色（第三区）、红色（第四区）。严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增区→产物分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。

2、清洁的实验用品：

实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。

3、污染监测　

需要设立阳性对照、阴性对照，进行重复试验， 选择不相同区域的引物进行PCR扩增等，做好污染监测，以便采取措施防止和消除污染。

4、规范操作

PCR实验室人员必须进行上岗培训，取得外部和内部上岗证后，方可从事基因扩增检验工作；

在操作中勤换手套，且不能与管盖内面接触，吸头、离心管装上滤嘴才能用；

要正确操作相关仪器设备，认真按照制订的合理、科学的操作规程操作相关仪器设备， 产生气溶胶污染；

若在各区域操作发生试剂、样品的外溅，此时工作人员先隔离其他未被污染的相关物品， 戴上手套和生物防护装置，用吸水纸吸干液体，对污染处用消毒液覆盖30min， 再用75%乙醇擦拭2遍，等试验结束后用紫外线照射30min；

若发生实验室工作人员工作服、鞋、帽被污染时， 必须立即脱掉并包裹好进行消毒处理，换上另外消毒好的工作服、鞋、帽等后方可继续工作。如果污染重则停止当天的下一步工作或另换其他具有资质的人员进行工作；

清洁工作及时、准确，每次实验前后用500mｇ/Ｌ的含氯消毒液擦拭地面及工作台面，75%乙醇擦拭仪器设备，再用紫外线照射整个实验区域及设备，时间不低于30min。实验室内的样品溶液和扩增产物产生的气溶胶是重要的污染源， 故PCR实验室要经常通风换气和消毒。当试验结束后产生的废弃反应管、 枪头等废弃物应置于2000mg/L的含氯消毒液中浸泡12h以上。废弃物需要经高压灭菌后按医疗废物进行消毒处理， 避免污染实验环境。

5、科学合理的管理

根据实际情况，制订科学、合理的关于PCR相关制度文件、 程序文件、标准操作规程及记录表格等文件，文件相关内容一定要有科学性、前瞻性、严谨性，并且操作性强，以便工作人员现场查阅和培训学习。

目前PCR技术广泛应用， 已经得到长足发展， 成为临床一些疾病诊断和预防控制领域的有力工具。为避免在PCR实验室内出现污染、 假阴性及假阳性结果等现象， 确保检验结果准确性， 实验人员应该不断提升检测能力， 具备应对污染的能力，控制污染蔓延， 将损失降到最小。